Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы - это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности.
Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед") имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие, Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого
(микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы

1. Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое; объективом;
7"". Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре;
8. Объектив;
9. выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.

Основную роль в получении изображения играет объектив . Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа , т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения - минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,- зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура-это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

где R - предел разрешения; - длина волны; NA - числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). «Сухой» объектив - это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии-кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
**Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии-обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Настройка освещения н фокусировка микроскопа

Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки света по Келеру , который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3)помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата;
9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора;
11)при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом

При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы - это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная , темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе

Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15 (рис. 1.13). Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.

Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точками препарата, при котором они еще четко различимы под микроскопом. Разрешающая способность обычных световых микроскопов с иммерсионной системой равна 0,2 мкм.

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «висячей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздавленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла.

На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива (рис. 1.15).

Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 1.17).

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Микроскопические методы исследования - способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М.м.и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1 ). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше,

чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2 ). Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования , способом микробиологической диагностики , находит применение в цитологических исследованиях и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей - флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования ). С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3 ). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как , вирусный , и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах,

определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400-250 нм ). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750-1200 нм . Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид М.м.и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии , в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия),

В данной статье мы ознакомимся широко развитой методикой исследования разнообразных микроэлементов нашего мира - микроскопией. Здесь мы рассмотрим описание микроскопа, его предназначение, устройство, правила работы и исторические факты.

Ознакомление с приборами микроскопии

Микроскоп - это механизм, предназначение которого заключается в получении увеличенного изображения какого-либо объекта, а также в измерении структурных деталей, которых невозможно наблюдать невооруженным глазом.

Изобретение и создание разнообразных видов микроскопов позволило создать микроскопию - технологический метод практической эксплуатации этих приборов.

Исторические сведения

Кем был создан первый микроскоп в истории человечества, определить довольно проблематично. Впервые такой механизм был изобретен на рубеже шестнадцатого и семнадцатого веков. Вероятным изобретателем считают Захария Янсена, голландского ученого.

Будучи еще ребенком, Янсен используя дюймовую трубочку, установил на двух ее краях по одной выпуклой линзе. Увиденное заставило изобретателя создать нечто новое и улучшить его. Возможно, это обусловило изобретение первого в мире микроскопа, что произошло приблизительно в 1590 году.

Однако еще в 1538 г. итальянец Дж. Фракасторо, работая врачом, выдвинул предположение о комбинировании двух линз с целью создания еще большего увеличения изображений. Следовательно, его работа могла стать началом для появления первого микроскопа. Хотя термин был введен гораздо позже.

Другим первооткрывателем считается Галилео Галилей. Услышав приблизительно в 1609 г. о появлении такого увеличительного устройства и разобравшись в общей идее его механизма, уже в 1612 г. итальянский физик создал собственное массовое изготовление микроскопов. Название этому прибору дал академический друг Галилея, Джованни Фабер в 1613.

Уже в шестидесятых годах XVII века были получены данные о применении микроскопа в научной исследовательской деятельности. Первый это сделал Роберт Гук, занимавшийся наблюдением за устройством разнообразных растений. Именно он в работе «микрография» сделал зарисовки увиденного в микроскоп изображения. Он установил, что растительные организмы строятся из клеток.

Разрешающие способности

Одним из параметров микроскопа является его разрешающая способность. Различные виды микроскопов имеют, соответственно, разный показатель этой характеристики. Так что же это такое?

Разрешающая способность - это возможности прибора показывать четкое и качественное изображение, картинку двух расположенных рядом, фрагментов исследуемого объекта. Показатель степени углубления в микромир и общая возможность его исследования базируются именно на этой способности. Данную характеристику определяет длина волны излучения, которую используют в микроскопе. Главным ограничением является невозможность получения картинки объекта, размеры которого меньше размера длины излучения.

Ввиду написанного выше становится очевидно, что благодаря разрешающей способности мы можем получать четкое изображение деталей изучаемого объекта.

Основные параметры

К другим важным параметрам в строении микроскопа относятся его увеличение, насадки, размер предметного столика, возможности подсветки, оптическое покрытие и т. д.

Рассмотрим главный из перечисленных в этом пункте показателей - увеличение.

Увеличение - это общая способность микроскопа показывать изучаемые объекты в больших размерах, чем они есть на самом деле. Вычисление этого параметра можно произвести путем умножения объективного увеличения на окулярное. Данная возможность в оптических микроскопах доходит до 2000 крат, а электронный имеет увеличение в сотни раз больше, чем световой.

Основная характеристика микроскопа - это именно его разрешающая способность, а также увеличение. Поэтому при выборе такого прибора на эти показатели необходимо обратить особое внимание.

Составные элементы

Микроскоп, как и любой другой механизм, состоит из определенных деталей, среди которых выделяют:

• предметный столик;
• рукоятку переключения;
• окуляр;
• тубус;
• держатель для тубуса;
• микрометренный винт;
• винт грубой наводки;
• зеркальце;
• подставку;
• объектив;
• стойку;
• бинокулярную насадку;
• оптическую головку;
• конденсор;
• светофильтр;
• ирисовую диафрагму.

Ознакомимся с основными характеристиками образующих структур микроскопа.

Объектив - является средством определения полезного увеличения. Образуется из определенного количества линз. Увеличительные возможности указываются цифрами на его поверхности.

Окуляр - состоящий из двух-трех линз элемент микроскопа, увеличение которого обозначается на нем цифрам. Общий показатель увеличительных способностей прибора определяется путем перемножения показателя увеличения объектива на увеличение окуляра.

Осветительные устройства включают в себя зеркальце или электроосветитель, конденсор и диафрагмой, светофильтр и столик.

Механическая система образуется подставкой, коробочкой с микрометренным механизмом и винтом, тубусодержателем, винтом грубой наводки, конденсором, винтом перемещения конденсора, револьвером и предметным столиком.

Оптическая микроскопия

Среди существующих видов микроскопов выделяют несколько основных групп, характеризующихся определенными особенностями устройства и предназначения.

Глаз человека - это своего рода естественная оптическая система с определенными параметрами, например, разрешением. Разрешение, в свою очередь, характеризуется наименьшим показателем разности в расстоянии между составными компонентами объекта, за которым наблюдают. Важнейшим пунктом здесь является наличие визуального отличия между наблюдаемыми фрагментами. Ввиду того, человеческий глаз не в силах наблюдать естественным путем за микроорганизмами, как раз и были созданы подобные увеличительные приборы.

Оптические микроскопы позволяли работать с излучением, лежащем в диапазоне от 400 до 700 нм и с ближним ультрафиолетом. Это длилось до середины двадцатого века. Подобные приборы не позволяли получать разрешающую способность меньшую, чем полупериод волны излучения опорного типа. Вследствие этого микроскоп позволял наблюдать за структурами, расстояние между которыми было около 0.20 мкм, из чего следует, что максимальное увеличение могло достигать 2000 крат.

Микроскопы бинокулярного типа

Бинокулярный микроскоп - это устройство, при помощи которого можно получить объемное увеличенное изображение. Другое название таких приборов - стереомикроскопы. Они позволяют человеку четко различать детали исследуемых объемных объектов.

В бинокулярном микроскопе рассмотрение объекта происходит сквозь две линзы, независимые между собой. В настоящее время используются сразу 2 окуляра и 1 объектов. Отлично работают в условиях наличия проходящего и отраженного света.

Электронная микроскопия

Появление электронного микроскопа позволило использовать электроны, обладающие свойствами и частиц, и волн в микроскопии.

Электрон обладает длинной волны, которая зависит от его энергетического потенциала: E = Ve, где V - величина разности потенциалов, e - электронный заряд. Длина волны электрона при пролете разности в потенциалах равной 200000 В составит около 0,1 нм. Электрон легко фокусируется при помощи электромагнитных линз, что обуславливается его зарядом. После электронную версию изображения переводят в видимую.

Среди таких увеличительных устройств набрал широкую известность цифровой микроскоп. Он позволяет подключать адаптеры к аппарату с целью переноса изображения на компьютер и его сохранения. При работе с подобными устройствами камера регистрирует наблюдаемое изображение, далее переносит его на ПК при помощи USB-кабеля.

Цифровой микроскоп может классифицироваться в соответствии с его режимом работы, увеличительной кратности, числу подсветок и разрешению камеры. Их главными достоинствами считаются наличие возможности переносить изображение на ПК и сохранять его, возможность в пересылке полученной информации на большие расстояния, редактирование, детальный анализ и хранение результатов исследования, а также умение проецировать картинку при помощи проекторов.

Электронные микроскопы обладают разрешающей способностью превосходящей световые в 1000-10000 раз.

Сканирующие зонды

Другой вид микроскопа - это сканирующий зонд. Сравнительно новая ветвь в развитии таких приборов.

Сокращенно их называют - ЗСМ. Изображение воспроизводится благодаря регистрации взаимодействия зонда и поверхности, которую он исследует. В современном мире такие механизмы позволяют наблюдать за взаимодействием зонда с атомами. Разрешающая способность ЗСМ сопоставима с микроскопами электронного типа, а в некоторых параметрах даже лучше.

Рентгеновская микроскопия

Рентгеновский микроскоп был создан для наблюдением за чрезвычайно малыми объектами, величина которых сопоставима с рентгеновскими волнами. Базируется на эксплуатации излучения электромагнитного характера, в котором длина волны не превышает один нанометр.

Разрешающая способность таких микроскопов заняла промежуточное место между оптическими и электронными. Теоретическая р.с. такого устройства может достигать 2-20 нм, что гораздо больше возможностей оптических микроскопов.

Общие сведения для работы с микроскопом

Эксплуатируя данный прибор необходимо знать правила работы с микроскопом:

1. Работу необходимо выполнять сидя.
2. Следует осмотреть прибор и протереть от пыли мягкими салфетками зеркальце, объектив и окуляр.
3. При работе с микроскопом нежелательно его передвигать, поставить слева от себя.
4. Произвести открытие диафрагмы, привести конденсор к верхнему положению.
5. Работу стоит начинать с малого увеличения.
6. Объектив довести до одного сантиметра от стекла с наблюдаемым объектом.
7. Равномерно распределить освещение поля зрения, используя окуляр, в который необходимо смотреть глазом, и вогнутое зеркало.
8. Переместить микропрепарат на столик микроскопа. Наблюдая сбоку, опустить объектив до уровня 4-5 мм над исследуемым объектом, используя для этого макровинт.
9. Глядя глазом в окуляр, производить вращательные движения грубого винта, для подведения объектива к положению, в котором будет четко видно изображение.
10. Перемещая стекло с препаратом, найдите место, где исследуемый объект будет располагаться по центру вашего поля зрения в микроскопе.
11. В случае отсутствия изображения, повторите с шестого по девятый пункты.
12. Используя микрометренный винт, добейтесь необходимой четкости изображения. Обратит внимание на то, не выходит ли точка между рисками на микрометренном механизме, за пределы рисок. Если выходит, то верните ее в стандартное положение.
13. Заключаем правила работы с микроскопом, уборкой рабочего места. Необходимо вернуть увеличение с большого на малое, произвести поднятие объектива, снять препарат и протереть микроскоп, далее накрыть полиэтиленом и вернуть в шкафчик.

Данные правила в большей мере относятся к оптическим микроскопам. Строение микроскопа, например, электронного или рентгеновского, отличается от светового, а потому основные правила работы могут также отличаться. Особенности работы с такими устройствами можно найти в инструкции к ним.

Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования

Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.

¨ Задание:

1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Таблица 2

Методы и техника микроскопирования

1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).

Различают:

Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .

в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.

г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.

д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.

е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.

3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.

Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.

С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.

Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.

Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.

В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.

Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.

Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.

Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.

А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.

3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.

Таблица 3

Препараты тканей с разным окрашиванием